През 1900 г. K. Landsteiner за първи път описва серологичната разлика между еритроцитите на различните индивиди и ги класира в една от четирите групи в зависимост от наличието на “аглутиногените” А или В. Това откритие дава началото на многобройни серологични, генетични и имунохимични проучвания на еритроцитната мембрана. Системата АВО има изключително голямо значение за трансфузионната практика, което се обуславя от наличието на естествени антитела – анти-А, анти-В, и анти-АВ, активни до 370С в серума на индивиди, чиито еритроцити не притежават кореспондиращия антиген. Ако хемотрансфузиите се осъществяваха без предварително определяне на кръвните групи от системата АВО около една трета от тях ще бъдат несъвместими. Ето защо подборът на АВО съвместима кръв между донор и приемател е задължителен и е в основата на всички претрансфузионни тестове.
Антигените от системата АВО се унаследяват по законите на Мендел. Многобройните генетични проучвания доказват, че системата АВО включва основно три гена А, В и О,. АВО групата на индивида се детерминира от наличието на един (хомозигот) или на два (хетерозигот) от трите алела.
С откриването на подгрупите А1 и А2 броят на възможните генотипни комбинации се увеличи на 10, а на фенотипите на шест
Значение на системата АВО. Огромното значение на тази система за трансфузионната практика се определя от наличието на естествени анти-А, анти-В и анти-А,В антитела в серума на всеки човек. В случаите, когато се извърши несъвместимо кръвопреливане по отношение на А и В антигените, настъпват тежки хемолитични реакции, протичащи с интравазална деструкция на прелетите еритроцити. Често пъти такива реакции завършват фатално за пациента. Не по-малко е значените на анти-А и анти-В IgG антителата за хемолитичната болест на новороденото при АВО несъвместимост между майката и плода. В съдебно-медицинската практика А и В антигените са един от основните генетични маркери.
КРЪВНОГРУПОВА СИСТЕМА RHESUS (Rh)
Rh системата се очертава като най-големия комплекс от антигени. След системата АВО тя заема второ място по клинично значение. С нейното откриване се установи причината за много посттрансфузионни реакции при преливане на АВО съвместима кръв; изясни се етиопатогенезата на хемолитичната болест на новороденото, което даде възможност за разработването на ефективни методи за профилактика и лечение.
Първоначалните проучвания, свързани с откриването на основния антиген – D са извършени почти едновременно от няколко групи изследователи. През 1939 г. Levine и Stetson първи допускат, че серологична несъвместимост между майка и дете е причината за erythroblastosis fetalis известна като хемолитична болест на новороденото. Авторите намират, че майчини антитела преминават във феталната циркулация и предизвикват деструкция на феталните еритроцити. Една година по-късно Wiener и Peters успяват да идентифицират подобно антитяло в серума на индивиди получили трансфузионна реакция след АВО съвместима кръв. През 1941 г Levin и сътр. съобщават, че това антитяло има същата специфичност като анти-Rhesus, получено от Landsteiner и Wiener чрез имунизация на зайци и морски свинчета с еритроцити от маймуната Maccacus Rhesus. С термина анти-Rh сега се означават клинично значимите човешки антитела. Rh антигените са кодирани от комплексен Rh локус, разположен в хромозома 1. RH локуса на човешкия геном съдържа два тясно свързани и високо хомоложни структурни гена RHD и RHCE, които кодират RhD и RhCcEe характеристиките съответно. Индивидите с D (+) еритроцити притежават два RH гена – RHD и RHCE, докато повечето от тези с D (-) еритроцити имат само един ген RHCE.
Честотата на разпространение на D антигена и силните му имуногенни качества създават благоприятни условия за алоимунизация след кръвопреливане и бременност.
Определяне на подгрупите на А антигена (А1 и А2) с тест-реагенти с анти-А и анти-Н
Установени са различни варианти в експресията на А антигена. Най-често срещаните подгрупи са А1 и А2. Всред европейците около 80% от изследвани лица от кръвна група А са носители на А1 антиген. За наличието на качествена разлика говори отчетливото диференциране на А1 и А2 антигените, когато се използват тест-реагенти анти-А1 и анти-Н, наличието на антитела анти-А1 в серума на някои индивиди от кръвна група А2 и особено от кръвна група А2В и унаследяване на подгрупите А1 и А2 по законите на Мендел.
Определяне на слаб D антиген (Du) по индиректен тест на Coombs
Слаб D (Du) фенотип
Слабият D фенотип се характеризира със силно редукцирана експресия на антигена, т.е. налице е количествена вариация в D. Доказано е, че броят на D антигенните места е около 5-10% от този на нормалните D (+) еритроцити. В рутинната практика слабият D се открива чрез индиректен антиглобулинов метод. Индивидите с този фенотип не могат да образуват алоимунни анти-D при бременност и при кръвопреливане.
Изследване за автоеритроантитела при фиксирани антитела върху еритроцитите—чрез директен антиглобулинов (Coombs) тест с поливалентен антиглобулинов серум, при свободни антитела в серума—чрез аглутинационен или ензимен метод
Антигените са чужди за организма високомолекулни субстанции, които при контакт с клетките на имунната система индуцират имунен отговор и специфично се свързват с ефекторните й звена – антитела или клетки.
Антителата са имуноглобулини, които имат способността да се свързват специфично със съответните антигенните детерминанти.
Алоантигени (изоантигени). Те определят генетичната индивидуалност и неповторимост на индивида т.е. те са израз на генетичните различия на всеки индивид от даден животински вид. Такива са антигените на кръвните клетки, на серумните белтъци, на серумните и клетъчни ензими и пр, които стоят в основата на имунните взаимоотношения майка-плод, на принципите на кръвопреливането и трансплантацията.
Автоантигени. При нормални условия антигенните структури на организма се приемат като “свои” и се разграничават от всичко “чуждо”. При някои патологични състояния този толеранс се нарушава и организмът започва да синтезира антитела, насочени специфично към антигените на собствените си клетки и тъкани т.е.имунокомпетентните клетки осъзнават собствените си антигени като чужди. Класически пример за това са автоимунните хемолитични анемии.
Антителата имат много важни биологични свойства. Те включват неутрализация на токсини, имобилизация на микроорганизми, аглутинация на клетки, активиране на серумния комплемен с последваща цитолиза, свързване с разтворими антигени и формиране на преципитати, преминават през плацентата от майката в плода и осигуряват неговата защита от бактериални и вирусни инфекции в ранния постнатален период. Различните изотипове антитела не са еднакви по отношение на биологичните си функции.
В кръвногруповата серология антителата се разделят на два основни типа: естествени и имунни. Към групата на естествените се отнасят антитела, които се откриват нормално в серума на индивида, без данни за явен (доказан) предшестващ антигенен стимул. Обикновено принадлежат към клас IgM. Имунните са обикновено от клас IgG и се формират след групово несъвместимо кръвопреливане или бременност.Някои от тях, за да проявят своето действие in vitro е необходима предварителна обработка на еритроцитите с ензими или използването на антиимуноглобулинови антитела. Обикновено са от клас IgG. Някои IgM засилват своето действие при използването на ензими.
В зависимост от температурния оптимум на действие антителата се разделят на топлинни и студови. Към първата група обикновено спадат имунните антитела от клас IgG активни на 37оС. Студовите антитела най-често са аглутиниращи, от клас IgM и реагират най-добре на температура 4о-15оС. Понякога обаче температурния диапазон на действие е доста голям, достига температура до 37оС, което в много от случаите определя и клинична значимост на антителата.
ХЕМОЛИТИЧНА БОЛЕСТ НА НОВОРОДЕНОТО
Основната причина за ХБН е свързането на D+ фетални еритроцити с майчините Rh(D) IgG антитела с последваща деструкция на сенсибилизираните фетални еритроцити. Хемолизата довежда до анемия на плода. Тъй като продукцията на еритроцити в костния мозък е недостатъчна, еритропоезата се връща в екстрамедуларните места – черен дроб, далак, бъбреци и надбъбреци. Rh алоимунизация се наблюдава у D отрицателни жени, които са имали една предшестваща бременност. Wiener през 1948 г. възкресява теорията на Darrow за фетоплацентарна хеморагия според която D+ фетални еритроцити преминават през плацентата в D- майка през време на бременността и раждането. Това присъствие на чужд антиген води до продукция на анти-Rh антитела. Проучванията на редица автори показват, че 99,2 – 99,3% от жените имат трансплацентарна хеморагия (ТПХ) до раждането. Наличието на фетални еритроцити в майчиното кръвообръщение се установява още след втория месец от бременността. Честотата на тази находка се увеличава през последните 3 месеца.
Когато серумът на бременна жена съдържа клинично значими еритроантитела от клас IgG, директно насочени към еритроцитен антиген на фетуса, преминали през плацентата във феталното кръвообръщение тези антитела могат да предизвикат деструкция на феталните еритроцити. Анемията и последиците от нея водят да смърт на плода in utero. Заболяването започва през интраутеринния живот и е описано като хемолитична болест на фетуса и новороденото. Хемолитичната болест дължаща се на анти-D е тежка. Като причина за смърт анти-с и анти-Кеll-антителата са следващите по значимост.
При скрининга за антиеритроцитни антитела се използва комплекс от високо чувствителни методи, обезпечаващи повторяемост и достоверност на резултатите, независимо от използваната техника. Това са аглутинационен, ензимен и антиглобулинов (Coombs) тест – директен и индиректен или други методи с еквивалентна чувствителност. При мониторирането на бременната жена се търсят както алоеритроантитела така и авто – свободни в серума и фиксирани върху еритроцитите.
Когато в серума на бременната се докажат антиеритроцитни антитела, следващата задача е да се определи специфичността на тези антитела, концентрацията им (титър) и клиничната им значимост по отношение на ХБН. С най голяма значимост са тези, реагиращи по индиректния антиглобулинов тест.
Когато в серума на бременната се установят клинично значими алоеритроантитела причиняващи ХБН, определянето на фенотипа на бащата дава възможност да се предвиди вероятния фенотип на детето. Ако двамата бъдещи родители са АВО съвместими, препоръчително е при скринига за еритроантитела да се използват и еритроцитите от партньора като тест-еритроцити.
*Определяне на Rh фенотип (СсDЕе) и Kell антиген с моноспецифични тест-реагенти
Определянето на Rh фенотипа се извършва с моноспецифични тест-реагенти: анти-D, анти-С, анти-с, анти-Е и анти-е.
Антигенът Kell е със сравнително малка честота. Той е силен имуноген с голямо клинично значение за трансфузионната практика и хемолитичната болест на новороденото. Анти-К са най-честите имунни антитела извън АВО и Rh системата в резултат на кръвопреливане и бременност.
*Определяне на имуноглобулиновата характеристика на еритроантителата (диференциран директен тест на Coombs) с моноспецифични антиимуноглобулинови тест-реагенти с анти-IgG и анти-комплементарен (С’) тест-реагент
Имунната деструкция на еритроцитите започва със свързването IgG или IgM антителата към антигенни детерминанти на еритроцитната мембрана като резултат от автоимунен или алоимунен процес. IgG сенсибилизираните еритроцити се разрушават директно (когато не е активиран комплемента) от клетките на РЕС (тъканните макрофаги), които имат рецептори за Fc частта на IgG молекулата. Имунната деструкция на IgM сенсибилизираните еритроцити е индиректен процес, който зависи от комплементната активация, тъй като липсват рецептори за Fc частта на IgM молекулата.
Клетките претърпяват директна комплемент-индуцирана интравазална хемолиза в повечето случаи предизвикана от високотитърни антитела от клас IgM. Наблюдава се рядко, тъй като еритроцитите притежават мембранни протеини, които специфично възпрепятстват комплемент-индуцираното увреждане. Индуциране на комплементмедиирана интраваскуларна хемолиза най-добре проличава при патологични условия, свързани с тежки трансфузионни реакции и пароксизмална студова хемоглобинурия.
Комплементсенсибилизираните еритроцити при проучванията in vivo показват, че деструкцията на еритроцитите се осъществява в черния дроб и обяснява защо пациенти със студовоаглутининова болест не се повлияват добре от спленектомия. Присъствието на фракциите на комплемента върху еритроцитната мембрана заедно с IgG антитела генерира силен фагоцитен сигнал. В тези случаи деструкцията се осъществява в черния дроб.
При липса на комплементно активиране, IgG сенсибилизираните еритроцити се секвестрират в далака. Спленектомията довежда до сигнификантно намаляване на деструкцията, докато при еритроцити сенсибилизирани с комплемент тя остава непроменена.
*Определяне специфичността и титъра на еритроантителата чрез аглутинационен, ензимен или антиглобуинов (Coombs) метод
Определяне титъра на имунните анти-А и анти-В антитела от клас IgG след обработка на серума с 2-меркаптоетанол чрез аглутинационен, ензимен или антиглобулинов (Coombs) метод
АВО – ХЕМОЛИТИЧНА БОЛЕСТ НА НОВОРОДЕНОТО (АВО-ХБН)
Хемолитичната болест на новороденото при АВО несъвместимост майка-плод се среща 6-7 пъти по-често от Rh(D) ХБН. Тя протича много по-леко в сравнение с другите форми на еритроцитна деструкция при алоимунизация спрямо D- и c- антигените от Rh-системата и Кell антигените.Обикновено се засягат децата от кръвна група А или В, родени от майка с кръвна група О. B повечето случаи заболяването протича леко без видими клинични изяви. Доказана е ниска степен на деструкция на еритроцитите, неонатална жълтеница с незначително по-ниска концентрация на Hb при АВО несъвместимите деца в сравнение с АВО съвместимите. ХБН-АВО може да се развие още при първа бременност